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Quantification of oxidative stress biomarkers: development of a method by ultra performance liquid chromatography
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
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Authors
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Abstract(s)
Thiol and purine compounds are widely distributed in nature. They are involved in physiological processes, such as, homeostasis and redox signalling, and disturbances of these functions are the basis of many human diseases. Therefore, there has been a great effort to better understand the metabolomics of these compounds.
The goal of the present work was to optimize an Ultra-High Performance Liquid Chromatography method for simultaneous detection and quantification of some thiol, and purine compounds in cells lysates and biological fluids.
For this purpose, an UPLC® system, equipped with an HSS T3 column, with fluorescence and photodiode array detection was used. Preliminary experiences to optimize chromatographic separation of standard compounds were accomplished and involved testing of conditions for sample pre-analytical treatments, mobile phase compositions and detection conditions.
A good resolution and separation was obtained for the standards tested. The thiols Glutathione, Cysteine and Homocysteine eluted at 0.655 0.005, 2.189 0.000 and 3.752 0.001 minutes. Intra-day precision of the method was 12.05, 9.87 and 9.06% for areas. Farther, inter-day precision for the retention times were 29.49, 1.63 and 2.24% and for areas were 41.55, 28.28 and 29.46%, respectively. Purines Adenosine and Inosine eluted at 2.249 0.001 and 2.584 0.005 minutes. Inter-day precision for the retention times were 0.06 and 0.01% and for areas were 6.99 and 6.63%, respectively. Linearity was tested in a range of concentrations from 5 to 100 M for thiols and 25 to 500 M for purines, with good results. Additionally, the detection and quantification limits were too high. Unfortunately, our analyses do not shown intra or inter-day precision. Therefore, the validation was not completed because reproducibility was inconsistent due to the mechanical failure of the chromatographic equipment used. However, we concluded that the identification of these analytes is possible with the methods established.
Os compostos tiólicos e as purinas encontram-se amplamente distribuídos na natureza. Estão envolvidos em vários processos fisiológicos, como a homeostasia e a sinalização redox. Perturbações destas funções estão na base de muitas patologias humanas. Por essa razão, existe um grande esforço da comunidade científica para entender estes compostos, particularmente ao nível da metabolómica. O objetivo deste trabalho foi otimizar um método de cromatografia líquida de ultra precisão para a deteção e quantificação destes compostos, em lisados celulares e fluidos biológicos. Com este propósito, foi usado o sistema cromatográfico UPLC®, equipado com uma coluna HSS T3 acoplado a detetores de fluorescência e fotodiodos em série para os tióis e purinas, respetivamente. Foram realizadas diversas experiências preliminares de otimização da separação dos padrões, onde foram testadas várias condições de pré-tratamento das amostras, diversas composições das fases móveis e condições de deteção. Foi possível obter uma boa resolução com os compostos tiólicos e com as purinas. O Glutatião, a Cisteína e a Homocisteína eluíram aos 0.655 0.005, 2.189 0.000 e 3.752 0.001 minutos. A precisão inter-diária dos tempos de retenção foi de 29.49, 1.63 e 2.24% e das áreas foi de 41.55, 28.28 e 29.46%, respetivamente. A linearidade do método foi testada numa gama de concentrações entre 5 e 100 M, com bons coeficientes de correlação. Os compostos purínicos Adenosina e Inosina eluíram aos 2.249 0.001 e 2.584 0.005 minutos. A precisão inter-diária dos tempos de retenção foi 0.06 e 0.01% e das áreas 6.99 e 6.63%, respetivamente. A linearidade do método foi testada numa gama de concentrações entre 25 e 500 M, com bons coeficientes de correlação. Infelizmente os resultados foram inconsistentes e a validação não foi alcançada, devido a falhas mecânicas do equipamento cromatográfico utilizado. Conclui-se que a identificação dos analitos é possível com os métodos estabelecidos.
Os compostos tiólicos e as purinas encontram-se amplamente distribuídos na natureza. Estão envolvidos em vários processos fisiológicos, como a homeostasia e a sinalização redox. Perturbações destas funções estão na base de muitas patologias humanas. Por essa razão, existe um grande esforço da comunidade científica para entender estes compostos, particularmente ao nível da metabolómica. O objetivo deste trabalho foi otimizar um método de cromatografia líquida de ultra precisão para a deteção e quantificação destes compostos, em lisados celulares e fluidos biológicos. Com este propósito, foi usado o sistema cromatográfico UPLC®, equipado com uma coluna HSS T3 acoplado a detetores de fluorescência e fotodiodos em série para os tióis e purinas, respetivamente. Foram realizadas diversas experiências preliminares de otimização da separação dos padrões, onde foram testadas várias condições de pré-tratamento das amostras, diversas composições das fases móveis e condições de deteção. Foi possível obter uma boa resolução com os compostos tiólicos e com as purinas. O Glutatião, a Cisteína e a Homocisteína eluíram aos 0.655 0.005, 2.189 0.000 e 3.752 0.001 minutos. A precisão inter-diária dos tempos de retenção foi de 29.49, 1.63 e 2.24% e das áreas foi de 41.55, 28.28 e 29.46%, respetivamente. A linearidade do método foi testada numa gama de concentrações entre 5 e 100 M, com bons coeficientes de correlação. Os compostos purínicos Adenosina e Inosina eluíram aos 2.249 0.001 e 2.584 0.005 minutos. A precisão inter-diária dos tempos de retenção foi 0.06 e 0.01% e das áreas 6.99 e 6.63%, respetivamente. A linearidade do método foi testada numa gama de concentrações entre 25 e 500 M, com bons coeficientes de correlação. Infelizmente os resultados foram inconsistentes e a validação não foi alcançada, devido a falhas mecânicas do equipamento cromatográfico utilizado. Conclui-se que a identificação dos analitos é possível com os métodos estabelecidos.
Description
Keywords
Thiols Purines Ultra high performance liquid chromatography Oxidative stress Tióis Purinas Cromatografia em fase líquida de ultra performance Stress oxidativo Applied Biochemistry . Faculdade de Ciências da Vida