Spheroid development for in vitro Chondrogenesis: preliminary studies

Jardim, Filipa Raquel Nunes

Publication

Spheroid development for in vitro Chondrogenesis: preliminary studies

2022-11-04Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas	pt_PT
datacite.subject.fos	Engenharia e Tecnologia::Engenharia Médica	pt_PT
dc.contributor.advisor	Tomás, Helena Maria Pires Gaspar
dc.contributor.advisor	Gonçalves, Mara Isabel Jesus
dc.contributor.author	Jardim, Filipa Raquel Nunes
dc.date.accessioned	2023-01-16T11:11:18Z
dc.date.available	2023-01-16T11:11:18Z
dc.date.issued	2022-11-04
dc.description.abstract	This thesis presents the first set of experimental work done at CQM – Centro de Química da Madeira aimed at the implementation of a new research line focused on spheroids for chondrogenesis study. Three different techniques for spheroid preparation using human mesenchymal stem cells (hMSCs) were tested. The preparation of spheroids by cell self-aggregation in ultra-low adhesion (ULA) cell culture plates was shown to be easy to use, and to lead to stable spheroids. The addition of 50 ng/mL carboxymethyl cellulose (CMC) to the cell culture medium helped to control spheroid’s size and spheroidicity, improving cell viability as well. The influence of different culture medium compositions on cell metabolic activity and on cell differentiation towards the chondrogenic lineage was evaluated in 2D cell cultures. The addition of TGF-β1, as well as other supplements, to the chondrogenic medium (CM) increased cell proliferation, and induced chondrogenesis (revealed through histochemical staining). For the assessment of the chondrogenesis in 3D constructs, spheroids were initially prepared and matured for 14 days (50 ng/mL of CMC was added to the medium at day 5) in ULA plates (poly-HEMA coating) in BM with high glucose content, at a high cell seeding density. Then, a spheroid group was exposed to CM; and another maintained in Basal medium (BM), as a control (CTRL) group for more 28 days (chondrogenesis induction). Spheroid’s growth was observed in the CM group, whereas their shrinking was evident in CTRL group. Also, CM led to higher cell viability values in spheroids. Histochemistry staining experiments were only successful using the Fast Green/Safranin O system, revealing the occurrence of chondrogenesis in spheroids exposed to CM. ALP activity measurements showed the absence of the hypertrophic phenotype in the differentiated spheroids (chondrospheres). Finally, ELISA assays allowed the detection of collagen type II and aggrecan in the chondrospheres cultured in CM.	pt_PT
dc.description.abstract	Esta tese apresenta o primeiro conjunto de trabalhos experimentais realizados no CQM – Centro de Química da Madeira com vista à implementação de uma nova linha de investigação centrada nos esferóides para o estudo da condrogénese. Foram testadas três técnicas diferentes para a preparação de esferóides utilizando células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs). A preparação de esferóides por auto agregação celular em placas de cultura celular de aderência ultra-baixa (ULA) demonstrou ser acessível, conduzindo a esferóides estáveis. A adição de 50 ng/mL de carboximetilcelulose (CMC) ao meio de cultura celular ajudou a controlar parâmetros como o tamanho e a esferoidicidade, melhorando também a viabilidade celular. A influência de diferentes composições do meio de cultura na atividade metabólica celular e na diferenciação condrogénica foi avaliada em culturas celulares 2D. A adição de TGF-β1, bem como de outros suplementos, ao meio condrogénico (CM) aumentou a proliferação celular, e induziu a condrogénese, tendo sido revelada através de coloração histoquímica. Para a avaliação do processo condrogénico em modelos tridimensionais, os esferóides foram inicialmente preparados e maturados durante 14 dias (tendo-se adicionado 50 ng/mL de CMC ao meio de cultura no quinto dia) em placas ULA (revestidas com poly-HEMA) em BM com elevado teor de glicose (4.5 g/L), e com uma alta densidade celular. Depois, um grupo esferóides foi exposto ao CM; e outro mantido em BM, como grupo de controlo (CTRL) durante mais 28 dias (indução da condrogénese). O crescimento dos esferóidesfoi observado no grupo CM, enquanto que a sua contração foi evidente no grupo CTRL. Além disso, o CM conduziu a uma viabilidade celular superior. A coloração histoquímica só foi bem sucedida utilizando o sistema Fast Green/Safranin O, revelando a ocorrência de condrogénese nos esferóides expostos ao CM. A atividade ALP revelou a ausência do fenótipo hipertrófico nos esferóides diferenciados (condroesferas). Finalmente, os ensaios ELISA permitiram a deteção de colagénio tipo II e agrecano nas mesmas.	pt_PT
dc.identifier.tid	203158156	pt_PT
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.13/4920
dc.language.iso	eng	pt_PT
dc.relation	Madeira Chemistry Research Centre
dc.relation	Madeira Chemistry Research Centre
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/	pt_PT
dc.subject	Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC)	pt_PT
dc.subject	Spheroids	pt_PT
dc.subject	Chondrogenic differentiation	pt_PT
dc.subject	Cartilage regeneration	pt_PT
dc.subject	Células estaminais mesenquimais humanas (hMSC)	pt_PT
dc.subject	Esferóides	pt_PT
dc.subject	Diferenciação condrogénica	pt_PT
dc.subject	Regeneração de cartilagem	pt_PT
dc.subject	Applied Biochemistry	pt_PT
dc.subject	.	pt_PT
dc.subject	Faculdade de Ciências Exatas e da Engenharia	pt_PT
dc.title	Spheroid development for in vitro Chondrogenesis: preliminary studies	pt_PT
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
oaire.awardTitle	Madeira Chemistry Research Centre
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oaire.awardURI	info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UIDB%2F00674%2F2020/PT
oaire.awardURI	info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UIDP%2F00674%2F2020/PT
oaire.fundingStream	6817 - DCRRNI ID
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project.funder.identifier	http://doi.org/10.13039/501100001871
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project.funder.name	Fundação para a Ciência e a Tecnologia
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rcaap.rights	openAccess	pt_PT
rcaap.type	masterThesis	pt_PT
relation.isProjectOfPublication	e30e13d9-be9a-4f34-91ea-a1682abce74e
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thesis.degree.name	Master in Applied Biochemistry	pt_PT