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Publication
Preliminary studies on the use of exosomes as dendrimer carriers
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Authors
Abstract(s)
Eukaryotic and prokaryotic cells can release vesicles into the biological fluids that differ in size and mechanism of biogenesis. In recent years, particular attention has been paid to exosomes which are naturally occurring nanoparticles (50 – 150 nm) that have been found in various biological fluids and are recognized as having an important role in intercellular communication and other biological processes. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are multipotent cells that can be found in different tissues in the adult. hMSCs have a large capacity for ex vivo expansion and show immunosuppressive properties, making them the ideal source of exosomes for biomedical applications.
Dendrimers are nanoscale molecules that have promising properties as drug/gene delivery vehicles and, as such, their inclusion inside hMSCs exosomes may be a way for their easier spreading and target reaching in the body. The present work was focused on the hypothesis that exosomes can be loaded before their isolation from cells by simple cell exposure to dendrimers. First, dendrimers were labelled with rhodamine and then characterized by 1H NMR, FTIR, UV/Vis spectroscopy, and fluorescence spectroscopy. Then, the effect of the pH in the stability of the fluorescence emission of these conjugates was study, as well as their cytotoxicity behavior and kinetics of cellular internalization. After, a protocol for exosome isolation was established using a precipitation-based approach and the isolated exosomes were characterized by DLS, TEM and acetylcholinesterase activity. hMSCs were then exposed to a solution containing the labelled dendrimers and the released exosomes were collected to evaluate the presence of the dendrimers inside. Contrary to what was expected, the dendrimers were not excreted inside exosomes and, instead, were accumulated in the cellular perinuclear zone. By fluorescence microscopy and using specific biochemical markers, it was possible to co-localize the conjugated dendrimers with the Golgi complex and the endoplasmic reticulum.
As células eucariotas e procarióticas podem libertar vesículas nos fluidos biológicos que diferem no tamanho e mecanismo de biogénese. Os exossomas, nanopartículas de ocorrência natural (50 - 150 nm), podem ser encontrados em diversos fluidos biológicos e possuem um papel importante na comunicação intercelular e noutros processos biológicos. As células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs) são células multipotentes que podem ser encontradas em diferentes tecidos adultos, que possuem uma larga expansão ex vivo e propriedades imunossupressoras. Os dendrímeros são moléculas com tamanhos nanométricos que possuem propriedades promissoras para a entrega de fármacos/genes e, como tal, a sua inclusão dentro de exossomas derivados de hMSC poderá representar uma maneira de facilitar a sua circulação no corpo de modo a atingirem os alvos biológicos. O presente trabalho focou-se na hipótese de que os exossomas podem ser carregados por simples exposição das células às soluções de dendrímero. Primeiro, os dendrímeros foram marcados com rodamina e caracterizados utilizando 1H RMN, FTIR, espectroscopia UV/Vis e espectroscopia de fluorescência. Depois, estudou-se o efeito do pH na estabilidade da emissão de fluorescência desses conjugados, bem como o seu comportamento de citotoxicidade e cinética de internalização celular. Seguidamente, os exossomas foram isolados por precipitação através da utilização de um reagente comercial e caracterizados por DLS, TEM e pela atividade da acetilcolinesterase. As hMSCs foram então expostas a uma solução contendo os dendrímeros e os exossomas libertados foram colhidos e avaliados de maneira a determinar a presença de dendrímeros no seu interior. Ao contrário do que era esperado, os dendrímeros não foram excretados dentro dos exossomas e, em vez disso, ficaram acumulados na região perinuclear das células. Por microscopia de fluorescência e utilizando marcadores bioquímicos específicos, foi possível co-localizar os dendrímeros conjugados com o complexo de Golgi e o retículo endoplasmático.
As células eucariotas e procarióticas podem libertar vesículas nos fluidos biológicos que diferem no tamanho e mecanismo de biogénese. Os exossomas, nanopartículas de ocorrência natural (50 - 150 nm), podem ser encontrados em diversos fluidos biológicos e possuem um papel importante na comunicação intercelular e noutros processos biológicos. As células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs) são células multipotentes que podem ser encontradas em diferentes tecidos adultos, que possuem uma larga expansão ex vivo e propriedades imunossupressoras. Os dendrímeros são moléculas com tamanhos nanométricos que possuem propriedades promissoras para a entrega de fármacos/genes e, como tal, a sua inclusão dentro de exossomas derivados de hMSC poderá representar uma maneira de facilitar a sua circulação no corpo de modo a atingirem os alvos biológicos. O presente trabalho focou-se na hipótese de que os exossomas podem ser carregados por simples exposição das células às soluções de dendrímero. Primeiro, os dendrímeros foram marcados com rodamina e caracterizados utilizando 1H RMN, FTIR, espectroscopia UV/Vis e espectroscopia de fluorescência. Depois, estudou-se o efeito do pH na estabilidade da emissão de fluorescência desses conjugados, bem como o seu comportamento de citotoxicidade e cinética de internalização celular. Seguidamente, os exossomas foram isolados por precipitação através da utilização de um reagente comercial e caracterizados por DLS, TEM e pela atividade da acetilcolinesterase. As hMSCs foram então expostas a uma solução contendo os dendrímeros e os exossomas libertados foram colhidos e avaliados de maneira a determinar a presença de dendrímeros no seu interior. Ao contrário do que era esperado, os dendrímeros não foram excretados dentro dos exossomas e, em vez disso, ficaram acumulados na região perinuclear das células. Por microscopia de fluorescência e utilizando marcadores bioquímicos específicos, foi possível co-localizar os dendrímeros conjugados com o complexo de Golgi e o retículo endoplasmático.
Description
Keywords
Extracellular vesicles Exosomes Mesenchymal stem cells PAMAM dendrimers Vesículas extracelulares Exossomas Células estaminais mesenquimais PAMAM-RITC Applied Biochemistry . Faculdade de Ciências Exatas e da Engenharia