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Publication
Investigation of possibilities for detection of stress hormones in Loggerhead sea turtles by MALDI TOF mass spectrometry
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 8.39 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Loggerhead sea turtles (Caretta caretta) are the most abundant and widespread
sea turtle species in Madeiran waters. The species is considered endangered
and is protected worldwide, as they encounter many stressors, whether nat ural or anthropogenic. Being high in the food chain they serve as effective
indicator of marine ecosystem health.
The most common method to evaluate the physiological stress is the mea surement of corticosterone (CS) levels in plasma. There are several analytical
methods for determination of plasma corticosterone concentrations, however
most of them require tedious and complicated procedures. The approach for
detection and fast screening of CS in blood of a turtle tested in this work was
simple, as MALDI does not require sample derivatization, which is extremely
useful for analysis of low sample volumes.
Since MALDI has limitations in analysis of small molecules, cholesterol
was used as a model system for development of the method and as well nano materials (carbon dots (CDs), N-doped carbon dots (N-CDs) and graphene)
were used in order to overcome signal suppression in presence of inorganic
salts. It was found that CDs and N-CDs are sensitive to the cholesterol and
can be used either alone or in a binary system with 2,5-dihydroxybenzoic
acid (DHB) to improve detection. In the presence of NaCl, N-CDs had a
better reproducibility of results. Afterwards, CS was subjected to analysis,
the linearity, precision and limit of detection and quantification with three
organic matrices were investigated. Signal-to-noise ratio of the CS-derived
signal was used as parameter for quantification.
In order to achieve better linearity and precision, isotopically labeled cor ticosterone was added at fixed concentration, as a correction factor. The
signal at m/z 347.4 belonging to CS was clearly detected. The lowest mea sured concentration of CS extracted from plasma that was still detectable
by MALDI-TOF MS was 0.04 mg/mL, which is approximately ten times
higher than expected CS concentration in a turtles’ blood. The results of
this work showed that this method has a potential for quantification of CS
in turtles’ blood, however the sensitivity is low, and the method need further improvements.
A tartaruga-marinha-comum (Caretta caretta) ´e a esp´ecie de tartaruga mar inha mais abundante e comum em ´aguas da Madeira. A esp´ecie ´e considerada amea¸cada e est´a sob prote¸c˜ao a n´ıvel mundial, pois ´e exposta a v´arios fatores de stresse, sejam estes naturais ou antropog´enicos. Estando numa posi¸c˜ao alta da cadeia alimentar, a sua presen¸ca serve como um indicador efetivo da sa´ude dos ecossistemas marinhos. O m´etodo mais comum para avaliar o stresse fisiol´ogico ´e a medi¸c˜ao dos n´ıveis de corticosterona (CS) em plasma. Existem v´arios m´etodos anal´ıticos para determinar a concentra¸c˜ao de corticosterona em plasma, por´em a maio ria deles consiste em opera¸c˜oes tediosas e complicadas. A abordagem ap resentada neste trabalho para a dete¸c˜ao e mensura¸c˜ao r´apida ´e simples – a MALDI n˜ao exige que se fa¸ca derivatiza¸c˜ao de amostras o que ´e extrema mente ´util para a an´alise de amostras de baixo volume. Como a MALDI tem limita¸c˜oes em rela¸c˜ao `a an´alise de pequenas mol´eculas, foi usado colesterol como o sistema modelo para desenvolver o m´etodo, bem como nanomateri ais (pontos de carbono (CD), pontos de carbono enriquecidos/dopados com nitrog´enio (N-CD) e grafeno) para resolver a supress˜ao de sinais na presen¸ca de sais inorgˆanicos. Foi constatado que os CD e N-CD reagem ao colesterol e podem ser usa dos ou individualmente ou num sistema bin´ario com o ´acido gent´ısico (DHB) para melhorar a sua dete¸c˜ao. Foi obtida uma melhor reprodutibilidade de re sultados usando N-CD na presen¸ca de NaCl. Posteriormente CS foi sujeita `a an´alise, apoiada em trˆes matrizes orgˆanicas, na qual foi investigada a lineari dade, precis˜ao e limita¸c˜oes da dete¸c˜ao e quantifica¸c˜ao. A rela¸c˜ao sinal/ru´ıdo do sinal derivado da CS foi usada como o parˆametro de quantifica¸c˜ao. Para obter uma maior linearidade e precis˜ao, foi acrescentada uma concentra¸c˜ao fixa de corticosterona marcada isotopicamente. A seguir, foi detetado clara mente o sinal de m/c 347.4 pertencente `a CS. A concentra¸c˜ao mais baixa da CS extra´ıda do plasma, ainda detet´avel, foi 0.04 mg/mL, o que apresenta um valor de concentra¸c˜ao da CS em sangue de uma tartaruga aproximadamente dez vezes superior ao esperado. Os resultados deste trabalho demonstram que o m´etodo eleito tem potencial de ser utilizado na pr´atica de quantifica¸c˜ao de sangue destes animais, embora com algumas limita¸c˜oes.
A tartaruga-marinha-comum (Caretta caretta) ´e a esp´ecie de tartaruga mar inha mais abundante e comum em ´aguas da Madeira. A esp´ecie ´e considerada amea¸cada e est´a sob prote¸c˜ao a n´ıvel mundial, pois ´e exposta a v´arios fatores de stresse, sejam estes naturais ou antropog´enicos. Estando numa posi¸c˜ao alta da cadeia alimentar, a sua presen¸ca serve como um indicador efetivo da sa´ude dos ecossistemas marinhos. O m´etodo mais comum para avaliar o stresse fisiol´ogico ´e a medi¸c˜ao dos n´ıveis de corticosterona (CS) em plasma. Existem v´arios m´etodos anal´ıticos para determinar a concentra¸c˜ao de corticosterona em plasma, por´em a maio ria deles consiste em opera¸c˜oes tediosas e complicadas. A abordagem ap resentada neste trabalho para a dete¸c˜ao e mensura¸c˜ao r´apida ´e simples – a MALDI n˜ao exige que se fa¸ca derivatiza¸c˜ao de amostras o que ´e extrema mente ´util para a an´alise de amostras de baixo volume. Como a MALDI tem limita¸c˜oes em rela¸c˜ao `a an´alise de pequenas mol´eculas, foi usado colesterol como o sistema modelo para desenvolver o m´etodo, bem como nanomateri ais (pontos de carbono (CD), pontos de carbono enriquecidos/dopados com nitrog´enio (N-CD) e grafeno) para resolver a supress˜ao de sinais na presen¸ca de sais inorgˆanicos. Foi constatado que os CD e N-CD reagem ao colesterol e podem ser usa dos ou individualmente ou num sistema bin´ario com o ´acido gent´ısico (DHB) para melhorar a sua dete¸c˜ao. Foi obtida uma melhor reprodutibilidade de re sultados usando N-CD na presen¸ca de NaCl. Posteriormente CS foi sujeita `a an´alise, apoiada em trˆes matrizes orgˆanicas, na qual foi investigada a lineari dade, precis˜ao e limita¸c˜oes da dete¸c˜ao e quantifica¸c˜ao. A rela¸c˜ao sinal/ru´ıdo do sinal derivado da CS foi usada como o parˆametro de quantifica¸c˜ao. Para obter uma maior linearidade e precis˜ao, foi acrescentada uma concentra¸c˜ao fixa de corticosterona marcada isotopicamente. A seguir, foi detetado clara mente o sinal de m/c 347.4 pertencente `a CS. A concentra¸c˜ao mais baixa da CS extra´ıda do plasma, ainda detet´avel, foi 0.04 mg/mL, o que apresenta um valor de concentra¸c˜ao da CS em sangue de uma tartaruga aproximadamente dez vezes superior ao esperado. Os resultados deste trabalho demonstram que o m´etodo eleito tem potencial de ser utilizado na pr´atica de quantifica¸c˜ao de sangue destes animais, embora com algumas limita¸c˜oes.
Description
Keywords
MALDI TOF MS Corticosterona Tartarugas Hormonas de stress Moléculas de baixa massa Corticosterone Turtles Stress hormones Low mass molecules Applied Biochemistry . Faculdade de Ciências da Vida